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RPKM值是怎么计算的
1、将RPM值除以基因长度（以千碱基为单位），获得RPKM。
2、目前常用RPKM （Reads Per Kilobase Million）， FPKM （Fragments Per Kilobase Million） 和 TPM （Transcripts Per Million）作为标准化数值。
3、在不考虑比对的剪切的情况下，readlreadl这个值往往都是一个固定值（如100bp或者150bp等），因此我们也可以将readlreadl统一约掉，那么分子就会蜕变成RPKM计算式的第一部分，但留着会更合理。
4、答案是不能，因为Rep1的总RPKM值是29，而Rep3的总RPKM值是25，虽然Rep1中基因A的RPKM大，但是Rep1的总RPKM值也是较大的（说白了，RPKM的测序深度标准化并不完善）。
5、由公式可知，知道了featurecount count 矩阵，同时有基因长度信息，可以计算RPKM.FPKM= read counts / （m***ed reads （Millions） * exon length（KB）目前最关键是如何计算 基因长度 ，以及如何衡量基因长度。
6、TPM的计算公式如下所示：同RPKM一样，TPM对基因的长度进行了校正，计算 比对到基因上的reads / 基因长度 得到 长度校正的表达量 reads per kilobase （RPK） 。再以文库中 RPK之和 作为Scale Factor求出TPM。
基因表达值定量方法RPKM、FPKM和TPM标准化的概念和比较
1、因此可看到，TPM与RPKM和FPKM相比，唯一的区别是先对基因长度进行归一化，然后对序列深度进行归一化。但是这种差异的影响非常明显。
2、TPM的计算方法其实同RPKM很类似，同样的对基因长度和测序深度进行标准化，只不过RPKM是先进行测序深度标准化，后进行基因长度标准化；而 TPM是先进行基因长度标准化，后进行测序深度标准化 。
3、FPKM和RPKM的定义是相同的，唯一的区别是FPKM适用于双端测序文库，而RPKM适用于单端测序文库。FPKM会将配对比对到一个片段（fragment）上的两个reads计算一次，接下来的计算过程跟RPKM一样。下面，终于轮到TPM登场了。
RNA-Seq归一化问题
RNA-Seq在衡量基因表达水平时，若单纯以比对到基因上的reads数来计算表达量在统计学上是不合理的。影响因素有： 基因长度：需要基因长度来比较同一细胞内不同基因之间的表达。
归一化过程中经常考虑的主要因素是：scRNA-seq中的每个细胞都将具有与之相关的不同数量的reads。因此，要准确比较细胞之间的表达，有必要对测序深度进行标准化。
差异基因 分析工作流程的第一步是计数归一化，这对于准确比较样品之间的基因表达是必需的。RNA-Seq（RNA测序的缩写）是一种实验类型，可让我们测量基因表达。
归一化的原因及处理原则：1）基因长度 2）测序量 3）样本特异性（例如，细胞mRNA总量，污染等）前两者使用普通的RPKM算法就可以良好解决，关键是第三个问题，涉及到不同的算法处理。
直接将bulk RNA-seq的归一化方法应用于scRNA数据集是不合适的。 推荐通过选择SCNorm或SCTransform归一化方法来更新分析流程并充分利用最新的技术方法是值得的。
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