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高通量测序技术及原理介绍
原理 将基因组 DNA 片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒 DNA。
测序原理：X-ten与Nova6000测序原理均是基于solexa的边合成边测序的原理；Nova6000***用Illumina的EX-AMP簇生成技术，以及新一代的Patterned Flow Cell。
高通量测序原理是将基因组DNA片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA。
第二代测序（Next-generation sequencing，NGS）又称为高通量测序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。
微生物多样性研究中测序原始数据及其处理方式
原始数据一切数据分析的根本。分析过程文件、结果文件可以丢失，原始数据在，分析结果可以重现；原始数据一旦丢失，分析结果则不可重现；原始数据应及时索取或保存。
S rRNA基因包括保守区和可变区，保守区反映了物种间的亲缘关系，而可变区则反映了物种间的差异。16S rRNA基因测序一般是利用MiSeq对16S rRNA基因的V3-V4可变区进行测序，以此来研究微生物多样性。
分析阳性对照：观察实验、测序环节是否有问题；2）比较分析不同测序run之间的阳性对照，排除测序批次间的差异性。3）按照要求分析该批次中的样本。
使用R软件Vegan包计算16s高通量测序数据的α生物多样性指数这里介绍一下用R软件中vegan包计算生物多样性指数的方法：R软件安装请自行搜索。第一步：制作数据矩阵。第二步，读取数据到R中。
如何理解微生物的多样性
微生物对环境的要求不高，对各种极端的环境，比如高温，高寒，缺氧等都能适应，所以其分布非常广泛，种类多样性很高。
体上讲，微生物种类多，且很多属于原核生物，DNA容易发生变异，从而造成性状甚至种类的变异。从结构上讲，微生物的通有结构是细胞壁细胞膜细胞质，间体，DNA区等等。
环境中存在丰富的微生物，通常从细菌和真菌两方面，考察样品中存在的微生物种类和数量，及其相互作用，如促进、拮抗等。来源于极端环境或者特殊环境的样品，较容易从中发现新菌种或对人类有益的菌，属于生态学范畴。
微生物多样性分析测序失败
所检测的试剂或者底物无效等原因。所选择的检测手段不准确等原因。
通过OTU分析，就可以知道样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度。测序区段：由于16s rDNA较长（5kb），我们只能对其中经常变化的区域也就是可变区进行测序。16s rDNA包含有9个可变区，分别是v1-v9。
通过otu分析，就可以知道样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度。
然后可以进一步分析 Beta多样性 ，主要我们会***用 PCA和PCoA 的方法，探究不同的组别微生物是否存在差异，以及是哪些因素影响了微生物的组成。
因为你用的是表达用的菌株，这里的质粒的拷贝数都不高，所以你可以把质粒自己提取出来，洗脱的时候少加点洗脱液，拿质粒去测序。还可以把这个质粒转到DH5a中，送去测序。
高通量测序分析微生物多样性一个样多少钱
1、我们目前的16s rDNA测序一个样本费用在350元左右，可以完成包括菌群检测、多样性分析和差异分析，还可以对样本的基因和功能进行预测分析，周期大概2周左右。
2、NGS 检测：高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（Next-generation sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。
3、首先说自己做DIY，提取微生物的DNA（一般用提取DNA的试剂盒），并测定DNA浓度和纯度，然后是做PCR扩增（引物为16S rRNA基因的通用引物，带barcode的515F/907R），接下来是纯化PCR产物（纯化试剂盒），构建library，送去测序。
4、主要看你筛查的范围和多少，一般都要以前多以上，筛查得越多，越贵，如果是做全外显子的话就要五六千，全基因组要上万，都不一样收费，你可以具体去咨询一下检验公司，比如华银。
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